지정된 화합물은 제공된 재료에 기초하여 차례로 합성됩니다. 각 화합물의 양에 대한 표적 값은 100 mg이다.

동일한 서열의 인산화 된 펩티드 및 비 인산화 된 펩티드는 항체 생성을위한 항원으로서 합성된다. malimmidated KHL과의 컨쥬 게이션을 위해, Cys 잔기는 끝에 위치하고 N- 말단 아세틸 화된다.

실화 된 펩티드는 효소 활성 억제제 펩티드로서 합성된다. N- 말단 아미노기 및 C- 말단 카르 복실 산이 펩티드 결합에 의해 결합되는시 클릭 펩티드 이외에, Cys 잔기의 측쇄를 사용한 티오 에테르-타입 사이 클릭 펩티드가 합성된다.

덱사메타손이 특정 길이의 링커를 통해 펩티드를 억제하는 효소 활성의 C- 말단 측면에 접합 된 펩티드가 합성된다.

지정된 유전자의 아미노산 코딩 영역은 cDNA로부터 PCR을 증폭시키고 N- 말단에 첨가 된 MYC-TAG와 함께 포유 동물 발현 벡터 플라스미드에 삽입된다. 삽입 시퀀스를 확인한 후, 미니-프리 크기 플라스미드가 제출된다.

지정된 유전자를 기능 장애로 절단하는 3 가지 유형의 가이드 RNA가 설계되었으며, 절단 효율은 세포를 사용하여 평가됩니다. 절단 효율이 가장 높은 가이드 RNA 및 CAS9를 발현하는 플라스미드를 준비하고 제출하십시오.

플라스미드를 제공하고 제출할 기본 렌티 바이러스를 준비하기 위해 ShRNA/siRNA 서열을 플라스미드에 소개합니다.

포유류 세포에서 발현하려는 유전자를 지정하고 의도 된 용도에 적합한 렌티 바이러스 준비 플라스미드를 설계하고 구성합니다. 플라스미드는 렌티 바이러스를 준비하고 제출하는 데 사용됩니다.

293 플로팅 세포 (30 ml x 6)는 아데노 관련 바이러스 제조를 위해 플라스미드와 함께 도입되고, 72 시간 동안 진탕 한 후, AAV 입자가 배양 된 세포의 세포질로부터 수집된다. 바이러스 부하는 QPCR에 의해 AAV 게놈을 측정하여 계산된다.

표현하려는 유전자를 기반으로 아데노 바이러스를 준비하기위한 코스 미드를 설계하고 구성합니다. 코스 미드는 아데노 바이러스를 준비하고 역가 결과와 함께 제출됩니다.

포유 동물 세포에서 발현하려는 유전자를 지정하고 의도 된 사용에 적합한 강제 발현 플라스미드를 지정하고 구성합니다. 플라스미드는 제공된 세포, 약물 선택, 클로닝 된, 클로닝되고, 트랜스 진의 발현은 실시간 RT-PCR에 의해 확인된다. 확인 된 발현을 갖는 세포 클론이 제출된다.

감염된 세포주는 각각 감염된 세포에서 shRNA를 발현하는 12 개의 렌티 바이러스 벡터 (시험 저자에 의해 제공됨)에 감염되어 선택된 세포 (벡터와 안정적으로 형질 감염된)에 제출된다.

지정된 유전자를 기능 장애로 절단하는 세 가지 유형의 가이드 RNA가 설계되었으며, 절단 효율은 세포를 사용하여 평가됩니다. 가장 효율적인 가이드 RNA 및 CAS9 플라스미드가 제조되고, 세포에 도입 된 후, 안정적으로 도입 된 클론이 분리된다. 각 클론에 대해, 표적 영역의 게놈 서열이 점검되고, 노출 된 것으로 여겨지는 클론이 제출된다.

DSF (차등 주사 형광 측정)는 10 개의 완충 조건 (pH, 염 농도, 다양한 첨가제 등)에서 해외 바카라 사이트의 변성 온도 TM을 측정하는 데 사용되며 가장 열 안정된 완충 조건 (저장에 적합한 조건)을 검사합니다.

SPR (Surface Plasmon Resonance Method)을 사용하여 하나의 수용체와 분석 물로서 6 개의 해외 바카라 사이트을 사용하여 센서 칩의 5 가지 농도 조건에서 상호 작용을 측정합니다. 각 상호 작용의 속도 상수 (KA, KD) 및 평형 상수 (KD)는 1 : 1 바인딩 모델 및 필요한 경우 2 개의 상태 또는 두 상태 모델을 사용하여 계산됩니다.

인간 및 설치류 펩티드 분해 효소 A의 경우, 세 가지 유형의 형광 기질 펩티드를 사용한 기질 분해 활성 분석 시스템이 확립된다. 확립 된 시스템은 알려진 억제제의 효과를 평가하는 데 사용됩니다.

해외 바카라 사이트은 96 개의 상이한 침전물의 존재하에 앉아있는 드롭 증기 확산 방법에 의해 결정화된다. 결정이 관찰 된 조건은 24- 웰 플레이트에서 교수형 드롭 증기 확산을 사용하여 개발된다. 결정이 얻어지면, 메틸렌 블루 염색에 의해 해외 바카라 사이트 결정인지 염 결정인지 결정됩니다. 동일한 조건에서 충분한 수와 결정의 품질이 얻어지면 동결 보호제를 검사합니다.

다른 특성의 배양 접시에서 폐암 세포주의 약물 반응성 (세포 증식)을 평가합니다. 폐암 세포주는 상이한 물질을 갖는 3 개의 다른 배양 접시에 시딩되며, 2 개의 다른 약물 희석 시리즈가 첨가된다. 약물 첨가 48 시간 후 세포 수를 평가하기 위해 MTS 분석을 수행하여 각 배양 접시에서 각 제제의 IC50을 결정합니다. 숫자의 재현성을 평가하기 위해 다른 날에 유사한 실험이 수행됩니다.

핵산은 4 가지 유형의 유도 시약을 사용하여 다양한 조건 하에서 인간 암 세포주에 도입됩니다. RNA는 도입 후 24 시간 내지 48 시간 세포로부터 추출되고, 표적 유전자의 발현 수준은 실시간 RT-PCR에 의해 정량적으로 평가된다.

제공된 세포주에 다양한 시험 물질이 첨가되고, 특정 기간 후에 인산화 된 표적 수용체 해외 바카라 사이트은 ELISA에 의해 측정된다.

신경 세포 및 성상 세포는 태아 마우스의 뇌 피질과 배양 된 1 차로부터 분리된다. 뉴런 및 성상 세포 마커는 각각 MAP2 및 GFAP이며, 이들의 해외 바카라 사이트 발현은 형광 면역 염색에 의해 확인된다. 뉴런/성상 세포 공동 배양에서, 시험 물질의 첨가 후 대사 물질 (ATP 등)의 농도가 측정된다.

핵산 약물 및 화합물과 같은 시험 된 물질은 배양 된 인간 IPSC 유래 또는 설치류 중추 신경계에 첨가되며, 세포 외 작용 전위는 MEA 장치를 사용하여 측정된다. 신경 에르지 성, 신경 독성 및 이온 채널/수용체 반응 프로파일과 같은 스크리닝에 필요한 조건을 설정합니다. 다변량 분석은 스파이크 데이터에 기초하여 수행되며, 설정 조건을 충족하는 화합물은 시험 물질 프로파일에서 선택됩니다.

인간 IPSC 또는 설치류 감각 신경 DRG를 배양하고, 시험 물질 또는 TRP 수용체에 특이적인 양성 대조군 화합물을 첨가하고, 신경 독성 및 표적 TRP 수용체를 평가한다.

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A 시스템은 384- 웰 플레이트에서 Tr-Fret/alphascreen을 사용하여 해외 바카라 사이트 A와 해외 바카라 사이트 B의 상호 작용을 측정하도록 설계되었으며 반응 측정 조건이 최적화됩니다.

모든 해외 바카라 사이트에 결합을 검출하기 위해 밀 세포가없는 시스템을 사용하여 384- 웰 플레이트에서 1,000 개의 해외 바카라 사이트이 합성됩니다. 알파 스크린을 사용한 해외 바카라 사이트-해외 바카라 사이트 상호 작용 측정 시스템은 결합 해외 바카라 사이트을 확인하기 위해 구성된다.

관심있는 성장 인자를위한 셀 리포터 분석 시스템 구성. 리포터 플라스미드는 성장 인자 및 루시퍼 라제의 다운 스트림 신호 반응 요소 (프로모터)로 구성된 구성된다. 플라스미드는 제공된 세포로 옮겨져 약물 선택 및 클로닝된다. 각각의 세포 클론에 대해, 루시퍼 라제의 증가 된 발현을 확인하기 위해 성장 인자가 첨가되고, 적절한 반응을 나타내는 세포 클론이 제출된다.

이미 확립 된 키나제 활성 평가 시스템을 사용하여 60 키나제에 대한 16 개의 화합물의 억제 전위가 평가됩니다. 키나제 용액을 연속 희석 및 1536- 웰 플레이트에 분배하고 키나제 활성에 의해 생성 된 화학 발광은 플레이트 리더에서 측정된다. 얻어진 측정 된 값에 기초하여, 각 화합물의 각 키나제에 대한 IC50을 계산한다.

표적 수용체 신호가 활성화 될 때 루시퍼 라제를 발현하는 세포 기반 분석 시스템을 사용하며, 제공된 25 가지 유형의 펩티드에 대한 표적 수용체에 대한 작용제 활성이 평가 될 것이다.

상업적으로 이용 가능한 GABAB 수용체 리포터 세포주 및 키트를 사용하여 GABAB 수용체에 대한 250 개의 시험 물질의 작용제 활성을 평가 하였다.

최적의 반응 및 측정과의 해외 바카라 사이트-핵산 상호 작용을 평가하는 HTRF/알파 스크린 분석 시스템을 사용하여 제공된 약 500,000 개의 화합물 (1536- 웰 플레이트에 분배)의 HTRF/알파스크린 측정을 수행합니다.

처음에는 수십 개의 인공 핵산이 배양 된 세포를 사용하여 시험 관내 시험에 적용되며, 표적 유전자의 mRNA 분석이 수행되고, 녹다운 효과가 높은 것들이 선택됩니다. 이어서, 마우스를 생체 내 연구에 사용하여 용량, 용량 수 및 지속 시간을 검사하고 표적 기관에서 표적 유전자의 녹다운 효율 및 독성을 분석 하였다. 최적의 투여 조건을 결정한 후, 모집단이 증가하고 표적 유전자 및 관련 표현형의 녹다운 효율이 분석된다.

해외 바카라 사이트 A 및 해외 바카라 사이트 B는 곤충 세포 (Baculovirus) 및 밀 세포가없는 발현 시스템을 사용하여 제조된다. A-B의 결합을 감지하는 알파 스크린 시스템은 설계되었으며 최적의 반응 조건이 조사된다.

PHAGE/ESCHERICHIA COOLI LIBRATION 제공된 항원 (라이브러리 및 항원의 9 가지 유형의 조합이 있음)과 항원에 반응하는 항체를 발현하는 파지가 농축됩니다. 농축 과정에서 항원에 대한 반응성은 ELISA를 사용하여 평가되며, 각 과정에 대한 라이브러리는 플라스미드 DNA로 준비됩니다.

노출 된 Cys 잔기를 통해 티올 커플 링에 의해 해외 바카라 사이트을 컨쥬 게이션하는 일련의 단편화 흐름에서 단편화 반응 조건의 단계, 제제 유형 및 농도 및 컨쥬 게이션 조건의 단계를 최적화합니다.